标准编号:	SN/T 4684-2016
中文名称:	进出口化妆品中洋葱伯克霍尔德菌检验方法
英文名称:	Determination of Burkholderia cepacia in cosmetics for import and export
行业分类:	SN    商检行业标准
发布机构:	国家质量监督检验检疫总局
发布日期:	2016-12-12
实施日期:	2017-7-1
标准状态:	valid
翻译语言:	英文
文件格式:	PDF
中文字符数:	11000 字
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Codeofchina.com is in charge of this English translation. In case of any doubt about the English translation, the Chinese original shall be considered authoritative. This standard is developed in accordance with the rules given in GB/T 1.1-2009. Attention is drawn to the possibility that some of the elements of this document may be the subject of patent rights. The issuing body of this document shall not be held responsible for identifying any or all such patent rights. This standard was proposed by and is under the jurisdiction of the Certification and Accreditation Administration of the People's Republic of China. Determination of Burkholderia cepacia in cosmetics for import and export 1 Scope This standard specifies the determination of Burkholderia cepacia in cosmetics for import and export. It is applicable to the qualitative determination of Burkholderia cepacia in cosmetics for import and export. 2 Normative references The following referenced documents are indispensable for the application of this document. For dated references, only the edition cited applies. For undated references, the latest edition of the referenced document (including any amendments) applies. GB 7918.1 Standard methods of microbiological examination for cosmetics - General rules GB 19489 Laboratories - General requirements for biosafety 3 Equipment and materials In addition to the conventional sterilization and culture equipment in microbiological laboratory, other equipment and materials are as follows. 3.1 Thermostatic incubator: 30℃±1℃, 32℃±1℃ and 36℃±1℃. 3.2 Homogenizer. 3.3 Oscillator. 3.4 Optical microscope. 3.5 Balance: with sensibility of 0.1g. 3.6 Aseptic pipette: 1mL, 10mL (0.1mL-scale) or micropipettor and sucker. 3.7 Aseptic culture dish: 90mm in diameter (or other commercial disposable aseptic culture dish). 3.8 Inoculation ring: 3mm in diameter. 3.9 Homogeneous bags or bottles. 3.10 Full-automatic microbe biochemical identification system. 4 Culture media and reagents 4.1 SCDLP enrichment broth containing polymyxin B: see A.1. 4.2 BCSA enrichment liquid containing gentamicin: see A.2. 4.3 BCSA agar containing polymyxin B and gentamicin: see A.3. 4.4 McConaughey agar containing polymyxin B and gentamicin (excluding crystal violet): see A.4. 4.5 Gram staining solution: see A.5. 4.6 Oxidase test reagent: see A.6. 4.7 Glucose oxidation/fermentation tube: see A.7. 4.8 Sucrose oxidation medium: see A.8. 4.9 Simmons citrate medium: see A.9. 4.10 Esculin medium: see A.10. 4.11 Biochemical identification kit. 5 Determination procedures See Figure 1 for the determination procedures of Burkholderia cepacia. Sample to be tested 10g(mL) sample + 90mL diluent 10mL + 90mL SCDLP enrichment broth (containing polymyxin B) 1mL + 10mL BCSA enrichment broth (containing gentamicin) BCSA agar (containing polymyxin B and gentamicin) MacConkey agar (containing polymyxin B and gentamicin) Select more than 5 suspicious colonies Carry out biochemical test, or select biochemical identification kit or full-automatic microbe biochemical identification system Report Figure 1 Determination procedures of Burkholderia cepacia 6 Operation steps 6.1 Enrichment culture Prepare 1:10 cosmetic diluent according to GB 7918.1 and add 10mL of diluent to 90mL of SCDLP enrichment broth containing polymyxin B, then culture at 36℃±1℃ for 24h, transfer 1mL of the obtained solution to 10mL of BCSA enrichment broth containing gentamicin, and culture at 36℃±1℃ for 18h to 24h. 6.2 Isolated culture Take a loop of BCSA enrichment broth with an inoculating loop respectively, subject it to streak inoculation on BCSA agar (containing polymyxin B and gentamicin) plate and MacConkey agar (containing polymyxin B and gentamicin) plate, and culture at 32℃±1℃ for 48h to observe the colonies growing on each plate. Typical colonies are red round colonies on BCSA agar plate and are smooth-faced, with the surrounding culture medium turns red; they are light yellow-brown round colonies on McConnell agar plate and are smooth-faced, with the color of surrounding culture medium unchanged. 6.3 Identification 6.3.1 Primary screening Pick more than 5 typical or suspicious colonies respectively from the selective agar plate. Inoculate the same strain into two glucose oxidation/fermentation tubes, seal one tube with sterilized liquid paraffin and do not seal the other tube. Then culture at 36℃±1℃ for 24h. If two tubes turn to yellow, it is glucose fermentation type; if the color of tube sealed with paraffin is not changed but the other tube turns to yellow, it is glucose oxidation type. At the same time, streak and purify on nutrient agar plate and culture at 36℃±1℃ for 24h. Select the pure culture of glucose oxidation type (the color of tube sealed with paraffin is not changed and the other tube turns to yellow) for further identification.

Foreword i 1 Scope 2 Normative references 3 Equipment and materials 4 Culture media and reagents 5 Determination procedures 6 Operation steps 7 Result report 8 Disposal of waste Annex A (Normative) Culture media and reagents GB/T QC/T

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4684—2016 进出口化妆品中洋葱伯克霍尔德菌 检验方法 Determination of Burkholderia cepacia in cosmetics for import and export 2016—12—12发布 2017—07—01实施 中华人民共和国 国家质量监督检验检疫总局 发布 前言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 进出口化妆品中洋葱伯克霍尔德菌 检验方法 1 范围 本标准规定了进出口化妆品中洋葱伯克霍尔德菌的检测方法。 本标准适用于进出口化妆品中洋葱伯克霍尔德菌的定性检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB 7918.1 化妆品微生物标准检验方法 总则 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 3设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下。 3.1 恒温培养箱：30℃±1℃、32℃±1℃、36℃±1℃。 3.2均质器。 3.3振荡器。 3.4光学显微镜。 3.5天平：感量0.1 g。 3.6无菌移液管：1 mL，10 mL(具0.1 mL刻度)或微量移液器及吸头。 3.7无菌培养皿：直径90 mm(或其他商业用一次性无菌平皿)。 3.8接种环：3 mm直径。 3.9均质袋或均质瓶。 3.10全自动微生物生化鉴定系统。 4培养基和试剂 4.1 含多粘菌素B的SCDLP增菌液：见A.1。 4.2含庆大霉素的BCSA增菌液：见A.2。 4.3含多粘菌素B、庆大霉素的BCSA琼脂：见A.3。 4.4含多粘菌素B、庆大霉素的麦康凯琼脂(不含结晶紫)：见A.4。 4.5革兰氏染液：见A.5。 4.6氧化酶试验试剂：见A.6。 4.7葡萄糖氧化/发酵管：见A.7。 4.8蔗糖氧化培养基：见A.8。 4.9西蒙氏枸橼酸盐培养基：见A.9。 4.10七叶苷培养基：见A.10。 4.11生化鉴定试剂盒。 5 检验程序 洋葱伯克霍尔德菌检验程序见图1。 检样 10 g(mL)样品+90 mL稀释液 10 mL+90 mL SCDLP增菌液(含多粘菌素B) 1 mL+10 mL BCSA增菌液(含庆大霉素) BCSA琼脂(含多粘菌素B、庆大霉素) 麦康凯琼脂(含多粘菌素B、庆大霉素) 挑取5个以上可疑菌落 生化试验或选用生化鉴定试剂盒 或全自动微生物生化鉴定系统 报告 图1 洋葱伯克霍尔德菌检验程序 6 操作步骤 6.1 增菌培养 按照GB 7918.1方法制备1：10化妆品稀释液，取稀释液10 mL加到90 mL含多粘菌素B的SCDLP增菌液中，于36℃±1℃培养24 h，移取1 mL，转种于10 mL含庆大霉素的BCSA增菌液内，于36℃±1℃培养18 h～24 h。 6.2 分离培养 分别用接种环取BCSA增菌液一环，划线接种于BCSA琼脂(含多粘菌素B、庆大霉素)平板和麦康凯琼脂(含多粘菌素B、庆大霉素)平板，于32℃±1℃培养48 h，观察各个平板上生长的菌落。典型菌落在BCSA琼脂平板上为红色圆形菌落.表面光滑，周围培养基变红；典型菌落在麦康凯琼脂平板上为浅黄褐色圆形菌落，表面光滑，周围培养基不变色。 6.3 鉴定 6.3.1 初筛 自选择性琼脂平板上分别挑取5个以上典型或可疑菌落，同一菌株接种于2支葡萄糖氧化/发酵管，其中一支加灭菌液体石蜡封口，另一支不封口，于36℃±1℃培养24 h，二者均变黄为葡萄糖发酵型，未加石蜡管变黄而加石蜡管不变色为葡萄糖氧化型。同时在营养琼脂平板上划线纯化，于36℃±1℃培养24 h。选择葡萄糖氧化型(加石蜡管不变黄，不加石蜡管变黄)的纯培养物继续进行鉴定。 6.3.2革兰氏染色 挑取可疑菌落涂片，进行革兰氏染色。显微镜下观察，洋葱伯克霍尔德菌为革兰氏阴性无芽孢杆菌。 6.3.3氧化酶试验 用玻璃棒或一次性接种针挑取单个特征性菌落，涂布在氧化酶试剂湿润的滤纸平板上。洋葱伯克霍尔德菌为迟缓型氧化酶阳性(紫红色、紫色或深蓝色)，反应时间约为2 min～10 min。 注：实验中切勿使用镍/铬材料。 6.3.4过氧化氢酶试验 用玻璃棒或一次性接种针挑取单个特征性菌落，置于洁净试管内，滴加3％过氧化氢溶液(临用时配制)2 mL，观察气泡产生情况。洋葱伯克霍尔德菌为迟缓产气，1 s后缓慢出现气泡。 6.3.5蔗糖氧化 挑取可疑菌落接种于蔗糖氧化培养基，36℃±1℃培养24 h，培养基变黄色为阳性，蓝色为阴性。洋葱伯克霍尔德菌为阳性反应。 6.3.6枸橼酸盐利用 挑取可疑菌落接种于西蒙氏枸橼酸盐培养基，36℃±1℃培养24 h.培养基变蓝色为阳性，浅绿色为阴性。洋葱伯克霍尔德菌为阳性反应。 6.3.7七叶苷利用 挑取可疑菌落接种于七叶苷培养基，30℃±1℃培养24 h，培养基变黑色为阳性，不变色为阴性。洋葱伯克霍尔德菌为阳性反应。 6.3.8 替代试验 可选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统，根据6.3.1的初步判断结果，对可疑菌落进行鉴定。 7 结果报告 综合以上试验结果，报告10 g(mL)样品中检出或未检出洋葱伯克霍尔德菌。 8废弃物处理 检测过程中的废弃物按照GB 19489的相关要求进行处理。 附 录 A (规范性附录) 培养基和试剂 A.1 含多粘菌素B的SCDLP增菌液 A.1.1 成分 酪蛋白胨 17 g 大豆蛋白胨 3 g 氯化钠 5 g 磷酸氢二钾 2.5 g 葡萄糖 2.5 g 卵磷脂 1 g 吐温80 7 g 蒸馏水 1 000 mL A.1.2 制法 将上述成分混合后，加热溶解，调pH为7.2±0.1分装，121℃高压灭菌20 min，备用。使用前，用过滤除菌方法加入多粘菌素B，使其终浓度为250 000 U/L。 A.2含庆大霉素的BCSA增菌液 A.2.1 成分 酪蛋白胨 10 g 酵母提取物 1.5 g 氯化钠 5 g 蔗糖 10 g 乳糖 10 g 酚红 0.08 g 结晶紫 0.002 g 蒸馏水 1 000 mL A.2.2 制法 将上述成分混合后，加热溶解，调pH为7.0±0.2分装，115℃高压灭菌15 min，备用。使用前，用过滤除菌方法加入庆大霉素，使其终浓度为10 mg/L。 A.3 含多粘菌素B、庆大霉素的BCSA琼脂 A.3.1 成分 酪蛋白胨 10 g 酵母提取物 1.5 g 氯化钠 5 g 蔗糖 10 g 乳糖 10 g 酚红 0.08 g 结晶紫 0.002 g 琼脂 14 g 蒸馏水 1 000 mL A.3.2 制法 将上述成分混合后，加热溶解，调pH为7.0±0.2分装.115℃高压灭菌15 min，备用。使用前，用过滤除菌方法加入多粘菌素B和庆大霉素，使其终浓度分别为600 000 U/L、10 mg/L，培养基混匀后倾注平皿。 A.4含多粘菌素B、庆大霉素的麦康凯琼脂 A.4.1成分 蛋白胨 20 g 乳糖 10 g 牛胆盐 5g 氯化钠 5g 中性红 0.03 g 琼脂 14 g 蒸馏水 1 000 mL A.4.2 制法 将上述成分混合后，加热溶解，调pH为7.2±0.2分装，115℃高压灭菌20 min，备用。使用前，用过滤除菌方法加入多粘菌素B和庆大霉素，使其终浓度分别为250 000 U/L、10 mg/L，培养基混匀后倾注平皿。 A.5革兰氏染液 A.5.1 结晶紫染色液 A.5.1.1 成分 结晶紫 1.0 g 95％乙醇 20.0 mL 1％草酸铵水溶液 80.0 mL A.5.1.2 制法 将结晶紫完全溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。 A.5.2革兰氏碘液 A.5.2.1 成分 碘 1.0 g 碘化钾 2.0 g 蒸馏水 300 mL A.5.2.2 制法 将碘与碘化钾先行混合，加入蒸馏水少许充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300 mL。 A.5.3沙黄复染液 A.5.3.1成分 沙黄 0.25g 95％乙醇 10.0 mL 蒸馏水 90.0 mL A.5.3.2 制法 将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。 A.5.4染色法 操作步骤如下： a) 涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染液，染1 min，水洗。 b)滴加革兰氏碘液，作用1 min，水洗。 c) 滴加95％乙醇脱色约15 s～30 s，直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗。 d)滴加复染液，复染1 min，水洗、待干、镜检。 A.6氧化酶试验试剂 A.6.1 成分 盐酸四甲基对苯二胺 1 g 蒸馏水 100 mL A.6.2 制法 将盐酸四甲基对苯二胺溶于蒸馏水即可。应使用新鲜配制的试剂，如放置于冷藏冰箱，应在配制后7 d内使用。 A.7 葡萄糖氧化/发酵管 A.7.1 成分 蛋白胨 1 g 牛肉膏 0.3 g 氯化钠 0.5 g 溴甲酚紫 0.004 g 蒸馏水 100 mL A.7.2 制法 将除指示剂外的各成分加热溶解，冷却后调pH为7.0±0.2，加入溴甲酚紫，充分溶解，加入0.5 g葡萄糖，混匀分装小试管，115℃高压灭菌15 min。 A.8 蔗糖氧化培养基 A.8.1 成分 蛋白胨 0.2 g 氯化钠 0.5 g 磷酸氢二钾 0.03 g 0.5％溴百里香酚蓝溶液 0.5 mL 蒸馏水 100 mL A.8.2制法 将除指示剂外的各成分加热溶解，冷却后调pH为7.0±0.2，加入溴百里香酚蓝溶液，121℃高压灭菌15 min，使用前，用过滤除菌方法加入蔗糖溶液，使其终浓度为1％，无菌操作分装小试管。 A.9 西蒙氏枸橼酸盐培养基 A.9.1 成分 柠檬酸钠 0.5 g 氯化钠 0.5 g 磷酸氢二钾 0.1 g 磷酸二氢铵 0.1 g 硫酸镁(MgSO4·7H2O) 0.02 g 0.5％溴百里香酚蓝溶液 1.6 mL 蒸馏水 100 mL A.9.2制法 将除指示剂外的各成分加热溶解，冷却后调pH为7.0±0.2，加入溴百里香酚蓝溶液，混匀分装小试管，121℃高压灭菌15 min。 A.10七叶苷培养基 A.10.1 成分 胰蛋白胨 0.5 g 牛肉膏 0.3 g 七叶苷 0.1 g 柠檬酸铁铵 0.05 g 蒸馏水 100 mL A.10.2 制法 将上述各成分加热溶解，冷却后调pH为7.0±0.2，分装小试管，115℃高压灭菌15 min。